优化PCR扩增体系 ？pcr扩增的体系配置？

今天给各位分享优化PCR扩增体系 的知识，其中也会对pcr扩增的体系配置进行解释，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在开始吧！

本文目录一览：

• 『壹』、pcr如何实现高效性
• 『贰』、定量PCR的优化
• 『叁』、影响实时荧光PCR的因素有哪些?
• 『肆』、PCR条件优化

pcr如何实现高效性

『壹』、PCR如何实现高效性优化PCR扩增体系 ？就是如何提高他的扩增效率的方法优化PCR扩增体系 ，一种提高pcr扩增效率方法，就是在反应体系中加入amp缓冲液。

『贰』、引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。

『叁』、【TA 克隆】TA 克隆方法（ Original TA Cloning Kit ）即利用 Taq 聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条 PCR 扩增产物的 3` 端自动添加一个 3`-A 突出端。利用 TaKaRa 的 T 载体，直接高效地连接 PCR 产物。

定量PCR的优化

第六步：一般的定量PCR反应体系与普通PCR其实也差不了多少，只是要加入Taqman探针，另外不同就是分步法的不同。

PCR反应体系的优化 PCR扩增过程必须保证扩增产物只有特异的目标产物，为此，首先要保证PCR反应体系达到最优。近来许多公司都有用于实时定量PCR反应的试剂盒，可以方便PCR反应的操作。

成功的定量PCR 实验离不开精准的实验设计和操作流程。实时萤光定量PCR分析的部分实施需要经过优化以确保所有反应参数均设置精确，从而获得准确的结果。

为了获取有意义的数据，这种情况下必须对qRT-PCR进行优化。没有正确地设置基线和阈值线 为了得到精确的Ct值，应当在丰度比较高的样品所对应Ct值两个循环之前设置基线。

优化MgCl模板DNA、热稳定DNA聚合酶及dNTP的浓度。

影响实时荧光PCR的因素有哪些?

RNA样品中的基因组DNA污染 提取的RNA样品中不可避免地混有少量的基因组DNA。基因组DNA对试验有两个影响：一是影响对RNA的精确定量；二是影响PCR扩增的特异性。

在决定实时荧光定量PCR检测灵敏度、准确性和可靠性的众多因素中，模板质量是决定重复性和生物学相关性的重要因素之一。诸多报告中也描述了生物样品中常见的抑制成分会导致qPCR分析灵敏度和动力学的显著降低。

扩增效率差有引物、试剂和pcr条件的原因。可以做温度梯度摸索实验，寻找最佳退火温度（扩增子的影响），还可以增加mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因。

PCR条件优化

扩增的目的产物条带较弱或不能检测到相应的条带。 试剂不合格；PCR仪有故障；扩增程序设置错误。 在两台不同的PCR仪上用新鲜购买的试剂与老的试剂分别进行PCR，比较其扩增产物结果。复性条件不是最合适的。

引物比较好在模板cDNA的保守区内设计。引物长度一般在15-30碱基之间。引物GC含量在40%-60%之间，Tm值比较好接近72℃。引物3′端要避开**子的第3位。引物3′端不能选取A，比较好选取T。

扩增量 使用Taq DNA Polymerase进行PCR产物克隆及食品、环境卫生检验等时，扩增量常常达不到要求。

出现多条条带表示PCR反应的特异性不高，可以进行如下优化尝试：适当提高PCR的退火温度。退火温度越高，DNA分子之间的配对越困难。这样可以减少引物与模板之间非特异性的结合。

扩增结果通过紫外透射检测：电泳是一般胶含有EB，可染色核酸，在紫外光激发下发出荧光，进行检测。同时DNA Marker 是一系列碱基数目大小比较明确条带，电泳时越靠近点样孔，条带的碱基数目越大，反之越小。

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